NaNoLens – widzieć więcej, dokładniej, szybciej

Bezsoczewkowa mikroskopia holograficzna otwiera zupełnie nowe możliwości obrazowania żywych komórek. Wykorzysta ją w projekcie NaNoLens dr hab. inż. Maciej Trusiak, prof. uczelni z Wydziału Mechatroniki Politechniki Warszawskiej. Na swoje badania otrzymał ERC Starting Grant.  

W 2014 r. Amerykanie Eric Betzig i William E. Moerner oraz Niemiec Stefan W. Hell zostali laureatami Nagrody Nobla za opracowanie mikroskopu fluorescencyjnego o bardzo wysokiej nanoskopowej rozdzielczości (zwanej super rozdzielczością) i rozwój tej techniki badawczej.

– Nanoskopia optyczna zrewolucjonizowała koncepcję „widzieć znaczy wierzyć”, ale ograniczenia w zakresie pola widzenia i konieczność stosowania znaczników fluorescencyjnych pokazały, że nadal są aspekty do udoskonalenia – mówi prof. Maciej Trusiak.

Delikatnie z komórkami

Komórki są przezroczyste. Konieczne jest znakowanie ich fluoroforami, które po prostu „świecą” jak żarówki nanoskopowych wymiarów pod mikroskopem. Absorbują energię i potem oddają ją jako promieniowanie. – Dla komórek, szczególnie żywych, fluorescencyjne barwienie to źródło stresu. Dodatkowo jest to kosztowne i czasochłonne – podkreśla prof. Maciej Trusiak. – Naukowcy starają się je obrazować tak samo dobrze, z równie wysokim kontrastem, ale bez konieczności znakowania. Ja i mój zespół uczestniczymy właśnie w takich badaniach – mówi.

Szerokie pole widzenia

W naukach biologicznych i biomedycznych kluczowe jest obrazowanie żywych komórek bez ingerencji, ale również w szerokim polu widzenia. Za pomocą standardowego mikroskopu można obserwować w wysokiej rozdzielczości od jednej do pięciu komórek z całej hodowli. Trzeba mieć szczęście, żeby trafić na moment i przestrzeń, kiedy i gdzie komórki zachowują się w sposób interesujący dla biologów i innych naukowców, biomedyków czy laborantów.  

 – W naszych badaniach wykorzystujemy mikroskopię fazową zapoczątkowaną przez laureata nagrody Nobla w dziedzinie fizyki z 1953 roku Fritsa Zernike. Jesteśmy czuli nie na to jak próbka absorbuje światło, czy jak je emituje, ale jak załamuje światło. W tym przypadku możemy obserwować komórki z dużym kontrastem bez żadnego znakowania – wyjaśnia naukowiec. – Druga sprawa, nie używamy obiektywów mikroskopowych, ponieważ wiążą się z nimi ograniczenia rozdzielczości, pola widzenia i głębi ostrości – dodaje.

NaNoLens

Metodą, która w sposób naturalny radzi sobie z problemem ograniczeń pola widzenia, jest bezsoczewkowa mikroskopia holograficzna. Wykorzystuje fizyczne podstawy poosiowej holografii, wprowadzone przez Dennisa Gabora, za co uzyskał nagrodę Nobla w dziedzinie fizyki w roku 1971. Komputerowa rekonstrukcja hologramu prowadzona jest w pełnym rozmiarze czujnika w celu uzyskania informacji o obiekcie bez stosowania znaczników.

Cały układ składa się z kamery, która rejestruje obraz (hologram), przed nią znajduje się badana próbka, którą oświetla źródło światła. Część światła rozprasza się na komórkach, dając informację, a część pozostaje nierozproszona. Dwie wiązki tworzą przeogniskowany hologram, który rejestrujemy na kamerze. Nie widzimy jednak próbki, tylko jej cień holograficzny.

– Możemy imitować numerycznie propagację światła w przestrzeni. Po rekonstrukcji hologramu (propagacji in silico) naszym oczom ukazuje się obraz podobny do tego jak w przypadku standardowego mikroskopu, gdybyśmy fizycznie dostrajali ostrość, ale w tym przypadku robimy to na komputerze – tłumaczy prof. Maciej Trusiak. – Rekonstruujemy numerycznie zarejestrowane wcześniej dane holograficzne. Algorytmem, obliczeniami wydobywamy z nich to, czego nie widać, czyli ilościowy kontrast fazowy ostrej próbki – dodaje.

Nadfiolet przełamie bariery

Główne wyzwanie, które pozostaje do pokonania w kontekście bezsoczewkowej mikroskopii holograficznej, to niska rozdzielczość przestrzenna (ok. 1 mikrometr) i poosiowa (ok. 3 mikrometrów).

– Rozdzielczość mówi nam o tym, jak blisko siebie mogą być dwa elementy, abyśmy mogli zobaczyć je oddzielnie, a nie jako jeden zlany ze sobą obiekt. Im wyższa rozdzielczość, tym więcej informacji możemy mieć o danej strukturze i lepiej ją obrazować – mówi prof. Maciej Trusiak. – W projekcie NaNoLens chcę wprowadzić bezsoczewkową holotomograficzną nanoskopię w głębokim UV jako kompaktowe rozwiązanie, które może być łatwo stosowane wewnątrz komory inkubacyjnej i poza laboratorium – zaznacza. – Wykorzystam krótszą długość fali – nadfiolet, ponieważ bezpośrednio koreluje ona z rozdzielczością i rozpraszaniem. Im krótsza długość fali, tym wyższa rozdzielczość – dodaje.

W standardowych mikroskopach sama konstrukcja urządzenia i droga, którą w urządzeniu przebywa wiązka, sprawiają, że nadfiolet jest pochłaniany, czyli znika źródła światła. Co więcej, nadfiolet w dawkach, które umożliwiają obrazowanie klasyczne, uszkadza DNA komórek, co może prowadzić do ich umierania. Jak naukowiec zamierza temu zapobiec?

– Po pierwsze, działając w holograficznym mikroskopie bezsoczewkowym nie wykorzystujemy żadnych elementów optycznych, więc nic nie pochłania nadfioletu poza badaną próbką – odpowiada prof. Maciej Trusiak.  – Jeśli chodzi o dawkę, już dowiedliśmy, że potrzebujemy zarejestrować w płaszczyźnie kamery niewiele fotonów, by rekonstrukcja numeryczna się powiodła. Będziemy testować, jak niskie może być to oświetlenie i czy możemy znaleźć takie, które w ogóle nie zaszkodzi komórkom – mówi.

12 tysięcy mikroskopów w jednym

Naukowiec chce poszerzyć naszą obecną wiedzę o dynamice pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (nano-bioobiektów emitowanych przez wszystkie komórki) w obrębie żywych hodowli komórkowych, z unikalną precyzją na poziomie pojedynczych pęcherzyków. Projekt zostanie zrealizowany w Grupie Ilościowego Obrazowania Obliczeniowego (ang. Quantitative Computational Imaging QCI LAB) pod kierunkiem prof. Macieja Trusiaka w składzie: prof. dr hab. inż. Krzysztof Patorski, dr hab. inż. Michał Jóźwik, prof. uczelni, dr inż. Piotr Zdańkowski, dr inż. Julianna Winnik oraz doktoranci i doktorantki: mgr inż. Maria Cywińska, mgr inż. Mikołaj Rogalski, mgr inż. Piotr Arcab i mgr inż. Emilia Wdowiak.

Zespół prof. Trusiaka prowadzi szeroką współpracę międzynarodową z naukowcami z Uniwersytetu w Walencji (Hiszpania), Uniwersytetu Nankińskiego (Chiny) i Uniwersytetu Arktycznego Norwegii w Tromsø oraz krajową z badaczami z instytutów PAN: Instytutem Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego oraz Instytutem Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. Mirosława Mossakowskiego. Będzie ona kontynuowana.

– Jeśli wszystko się powiedzie, możliwe będzie obrazowanie w tak szerokim polu, które byśmy uzyskali łącząc ze sobą pola z przeszło 12 tysięcy mikroskopów fazowych obecnie dostępnych na rynku – zaznacza prof. Maciej Trusiak. – Jeśli chodzi o przepustowość informacyjną, która obecnie liczona jest w megapikselach, będę chciał uzyskać poziom dziesiątek gigapikseli – dodaje.

Na realizację projektu „Lensless label-free nanoscopy” (NaNoLens) naukowiec otrzymał 1,5 mln euro w ramach grantu ERC Starting Grant, przyznanego przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (European Research Council – ERC). Badania rozpoczną się w styczniu 2024 r. i potrwają 5 lat.